Fabuła gry oparta jest na biblijnej historii opowiadającej o Abrahamie i próbie wiary jakiej poddał go Bóg, gdy nakazał mu złożenie syna Izaaka w ofierze. W The Binding of Isaac: Rebrith gracze wcielają się w małego chłopca i ukrywają się przed niebezpieczeństwem w piwnicy domu, która okazuje się koszmarnym labiryntem zamieszkanym przez demony i stwory z najgorszych model rozgrywki nie zmienił się w stosunku do pierwotnej wersji The Binding of Isaac. Gracze przemieszczają się po generowanym losowo labiryncie komnat, razem tworzących poziom zakończony walką z bossem. W trakcie eksploracji natrafimy na różnego rodzaju przedmioty, wpływające na statystyki bohatera. Poszczególne levele mogą zawierać także sklepy, pomieszczenia z ukrytymi skarbami oraz inne sekretne lokacje, których odkrycie wymaga wielokrotnego przechodzenia gry. Dużą rolę w The Binding of Isaac odgrywają także przedmioty służące do interakcji z otoczeniem. Bombami wysadzimy stojące nam na drodze przeszkody lub wrogów, za pomocą kluczy otworzymy natomiast liczne skrzynie i drzwi do zabezpieczonych komnat. Z czasem odblokujemy także dodatkowe postacie, różniące się siłą i bonusami dostępnymi przy rozpoczęciu z nimi nowej Binding of Isaac: Rebrith zawiera wszystko to, co mogliśmy znaleźć w dwóch zestawach DLC dla The Binding of Isaac, jak również zawartość jaka nie znalazła się w oryginalne ze względu na ograniczenia technologiczne. Nowością jest także lokalny tryb kooperacji, pozwalający na wspólne zwiedzanie labiryntu ze graficzna została znacząco zmieniona tak, by przypominała klasyczne tytuły z 16-bitowych konsol. Projekty przedmiotów, postaci czy wrogów nie uległy znaczącym przekształceniom, ale dzięki „pikselowemu” wyglądowi nabrały jednak nowego uroku.